Полимеразная цепная реакция в реальном времени

Часто используется в качестве экспресс-метода для индикации и идентификации вирусов.

Описание метода

Процедура кПЦР похожа на процедуру классической ПЦР, то есть присутствуют все стадии реакции — плавление двухцепочечных ДНК при температуре 95˚C, отжиг праймеров (температура отжига зависит от используемых праймеров) и элонгация при температуре 72˚С, если используется Taq-полимераза. Количество ПЦР-продукта измеряется в каждом цикле ПЦР с помощью флуоресцентных меток. Таким образом, сила сигнала говорит о первоначальном количестве интересующей молекулы[4].

График амплификации График амплификации в кПЦР

Номенклатура, обычно используемая для кПЦР:

  1. Базовая линия — это циклы ПЦР, в которых флуоресцентный сигнал ниже значения, которое может зарегистрировать прибор.
  2. ΔRn — приращение флуоресцентного сигнала в каждый момент времени.
  3. Пороговая линия — это произвольный уровень флуоресценции, выбранный на основе базовой линии. Сигнал, который обнаружен выше порога, считается реальным сигналом, который можно использовать для определения порогового цикла (Ct) для образца. Порог можно регулировать для каждого эксперимента, чтобы он находился в области экспоненциального роста на всех графиках.
  4. Пороговое число циклов (Ct) — это число циклов ПЦР, при котором флуоресценция превышает пороговое значение.

График состоит из базовой линии, экспоненциальной фазы и плато[5].

А — график амплификации. Зависимость уровня флуоресценции от цикла ПЦР для нескольких образцов. В — кривая плавления. На оси ординат производная флуоресценции по температуре со знаком минус, на оси абсцисс — температура. С — кривая плавления. Уровень флуоресценции по времени

На начальных этапах флуоресценция слабая, так как продукта мало, поэтому её трудно отличить от фона. По мере накопления продукта, сигнал растёт сначала экспоненциально, а затем выходит на плато. Выход на плато объясняется нехваткой того или иного компонента реакции — могут закончиться праймеры, нуклеотидилтрифосфаты, флуоресцентная метка. Если продукта реакции накопилось слишком много, то лимитирующим фактором может стать полимераза, и тогда зависимость количества продукта от цикла станет линейной. Стоит отметить, что в стандартной реакции ПЦР в реальном времени все образцы выйдут на плато и достигнут примерно одного уровня сигнала. Таким образом, конечная точка ничего не скажет о начальном количестве исследуемого образца. С другой стороны, в экспоненциальной фазе можно проследить отличия в скорости роста количества продукта. Различия в начальном количестве молекул влияют на количество циклов, необходимых для поднятия уровня флуоресценции выше уровня шума[5].

Ct — число, по которому можно судить о количестве целевой ДНК в растворе, но Сt-величина может зависеть от многих случайных факторов, например,чувствительности детектора, качества фильтра и пр. Поэтому точное начальное количество интересующего продукта измерить нельзя. Для решения этой проблемы существуют методы нормировки. Измеряют отношение количеств двух молекул в пробе. Нормируют обычно на продукты генов домашнего хозяйства — генов, количество которых в клетке всегда примерно одинаковое (пример — ген infA, ирующий фактор инициации трансляции у бактерий). Соотношение определяют по следующей формуле:

Читайте также:  Красный плоский лишай слизистой оболочки полости рта

[ N 0 ] A / [ N 0 ] B = ( 1 + E ) ( C t B − C t A ) {\displaystyle [\mathrm {N} _{0}]_{A}/[\mathrm {N} _{0}]_{B}=(1+\mathrm {E} )^{(\mathrm {Ct} _{B}-\mathrm {Ct} _{A})}}

где [ N 0 ] A {\displaystyle [\mathrm {N} _{0}]_{A}} и [ N 0 ] B {\displaystyle [\mathrm {N} _{0}]_{B}}  — начальные количества двух образцов, CtB и CtА — соответствующие Ct-величины, а E {\displaystyle \mathrm {E} }  — эффективность ПЦР, которая часто приравнивается к 1 {\displaystyle 1} или 0 , 9 {\displaystyle 0,9} [5].

Анализ кривой плавления

ПЦР в реальном времени позволяет идентифицировать конкретные амплифицированные фрагменты ДНК, используя анализ их температуры плавления (денатурации), также называемый величиной Tm. В методе используются интеркалирующие красители, обычно это SYBR Green. Температура плавления ДНК специфична для амплифицированного фрагмента. Результаты этого метода получены путём сравнения кривых диссоциации анализируемых образцов ДНК. Для анализа строится две кривые плавления. Первая — это зависимость флуоресценции по времени, вторая — скорость падения флуоресценции по времени. Пик отражает определённый образец ДНК[5].

Преимущества ПЦР:

  • для анализа методом ПЦР пригоден абсолютно любой биологический материал;
  • специфичность ПЦР равна 100% (при правильном выполнении ПЦР ложноположительный результат невозможен);
  • высокая чувствительность (ПЦР позволяет выявить от нескольких копий до одного возбудителя в образце);
  • одновременно можно выявить несколько возбудителей в одном образце;
  • динамика численности возбудителя заболевания (ПЦР позволяет определять количество копий возбудителя в образце, что позволяет оценить эффективность проводимой терапии);
  • процесс полностью автоматизирован и результат ПЦР можно получить через несколько часов после начала исследования.

Основы ПЦР

Основа метода — многократное избирательное копирование (амплификация) определённого участка ДНК с целью получения такого количества генетического материала, которого будет достаточно для визуального обнаружения. При этом многократно копируется только заданный участок ДНК при условии, что он присутствует в исследуемом биоматериале.

Кроме того, исследование позволяет проводить другие манипуляции с генетическим материалом. Поэтому метод широко применяется в научных исследованиях, биологической и медицинской практике: в диагностике инфекционных и наследственных заболеваний, при выявлении мутаций, генотипировании, установлении отцовства, идентификации личности и др.

Читайте также:  Как вовремя распознать и как лечить стоматит у детей?

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод диагностики, позволяющий диагностировать инфекционные и наследственные заболевания точнее и быстрее, чем другие существующие на сегодняшний день методы. Для проведения исследования методом ПЦР достаточно небольшого количества биологического материала (могут быть использованы кровь, биологические жидкости, ткани).Чаще всего анализ ПЦР используется при диагностике таких заболеваний, как хламидиоз и микоплазмоз. При этом берут на анализ кровь, мазки или соскобы. Немаловажно, что при помощи ПЦР можно поставить точный диагноз при таких серьезных заболеваниях, как гепатит С и ВИЧ: ложноположительные или ложноотрицательные результаты для этого метода не свойственны. Метод ПЦР позволяет выявить опасные заболевания на ранних стадиях, что во многих случаях может спасти человеку жизнь.Кроме наличия или отсутствия в предоставленном на анализ биологическом материале опасных микроорганизмов, бактерий или вирусов, при помощи ПЦР определяется вирусная нагрузка – количество ДНК вирусов в предоставленном на анализ образце, что позволяет оценить тяжесть инфекционного заболевания. Метод ПЦР позволяет выявить наличие даже очень небольшого количества бактерий и вирусов в исследуемом материале: чувствительность анализа ПЦР составляет 10-100 клеток в образце.

При помощи ПЦР можно определить отцовство. Также этот метод используется в криминалистике для идентификации ДНК жертвы или подозреваемого.Желательно, перед сдачей биологического материала на анализ методом ПЦР, не употреблять алкоголь. Если на анализ берется мазок из шейки матки, влагалища или уретры, то за 3 часа до сдачи анализа нельзя мочиться, а накануне сдачи анализа не стоит подмываться, за 3 дня до сдачи анализа нужно отказаться от интимной близости. На точность метода не влияют никакие заболевания. Беременность также не может повлиять на результат анализа ПЦР.В нашей лаборатории анализ ПЦР принимается в первой половине дня, а результаты будут готовы уже к вечеру (максимум — на следующий день). Для проведения анализа методом ПЦР используются реактивы и оборудование, экспортируемое из США и Европы, поэтому его стоимость высокая (что оправдывается точностью анализа). За каждый вид болезни, на которую проверяется биологический материал, берется отдельная плата, возможно проведение комплексного обследования материала на несколько видов заболеваний.

     Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

Читайте также:  Можно ли употреблять алкоголь при язве?

1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук" (ГНУ ВНИИКОП Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (Протокол от 14 ноября 2013 г. N 44)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Код страны поМК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Армения

AM

Минэкономики Республики Армения

Беларусь

BY

Госстандарт Республики Беларусь

Киргизия

KG

Кыргызстандарт

Молдова

MD

Молдова-Стандарт

Россия

RU

Росстандарт

Узбекистан

UZ

Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. N 2074-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 22118-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 22118:2011* Microbiology of food and animal feeding stuff. Polymerase chain reaction (PCR) for the detection and quantification of food-borne pathogens. Performance characteristics (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения и количественного учета патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Технические характеристики).

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. — Примечание изготовителя базы данных.

Международный стандарт разработан техническим комитетом CEN/TC 275 "Food analysis — Horizontal methods" совместно с подкомитетом ISO ТС 34/SC 9 "Microbiology" технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Food products" Международной организации по стандартизации (ISO).

Перевод с английского языка (en).

Официальный экземпляр международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, имеется в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии.

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам приведены в дополнительном приложении ДА.

Степень соответствия — идентичная (IDT)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Март 2016 г.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет